Um agonista Nurr1 otimizado fornece doença | Chengdu CFilling Machine Group Co., Ltd

Nature Communications volume 14, número do artigo: 4283 (2023) Citar este artigo

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O receptor nuclear, Nurr1, é crítico tanto para o desenvolvimento quanto para a manutenção dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo, representando um alvo molecular promissor para a doença de Parkinson (DP). Identificamos anteriormente três agonistas de Nurr1 (amodiaquina, cloroquina e glafenina) que compartilham uma estrutura química idêntica, 4-amino-7-cloroquinolina (4A7C), sugerindo uma relação estrutura-atividade. Aqui relatamos uma pesquisa sistemática de química medicinal na qual mais de 570 derivados de 4A7C foram gerados e caracterizados. Vários compostos melhoram a atividade transcricional de Nurr1, levando à identificação de um agonista penetrante no cérebro otimizado, 4A7C-301, que exibe efeitos neuroprotetores robustos in vitro. Além disso, 4A7C-301 protege os neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo no modelo de DP de camundongos machos induzidos por MPTP e melhora os déficits olfativos motores e não motores, sem comportamentos semelhantes aos da discinesia. Além disso, 4A7C-301 melhora significativamente as anormalidades neuropatológicas e melhora as disfunções motoras e olfativas em modelos de camundongos machos com superexpressão de α-sinucleína mediados por AAV2. Estas propriedades modificadoras da doença de 4A7C-301 podem justificar a avaliação clínica deste ou de compostos análogos para o tratamento de pacientes com DP.

A doença de Parkinson (DP), que afeta 2–3% da população com mais de 65 anos, é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, depois da doença de Alzheimer1,2,3. A degeneração seletiva dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo (mDANs) na substância negra e o acúmulo e agregação neurotóxica de α-sinucleína (αSyn) nos corpos de Lewy são características patológicas marcantes da DP. Acredita-se que a manifestação da DP seja causada pela ação combinada de fatores genéticos e ambientais através de múltiplas vias de interação, incluindo disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, neuroinflamação e degradação/autofagia desregulada de proteínas3,4,5,6,7. Atualmente, a terapia de reposição de dopamina (DA) (por exemplo, L-DOPA) é o tratamento padrão-ouro. Embora melhore significativamente a qualidade de vida dos pacientes com DP, a janela terapêutica sem efeitos colaterais inaceitáveis, como discinesia, e o grau de benefício diminuem ao longo do tempo8,9, e não há tratamento que possa interromper ou retardar a progressão da doença. Portanto, há uma grande necessidade não atendida de desenvolver um novo tratamento modificador da doença para a DP10,11.

Durante as últimas décadas, as cascatas regulatórias transcricionais dos mDANs foram exaustivamente estudadas . Duas principais vias de desenvolvimento de mDAN (isto é, Sonic hedgehog-FoxA2 e Wnt1-Lmx1A) convergem para induzir Nurr113,14,15, destacando Nurr1 como um regulador mestre para mDANs. De fato, estudos de nocaute de Nurr1 (KO) e KO condicional demonstraram que Nurr1 é essencial não apenas para o desenvolvimento, mas também para a manutenção de mDANs adultos. Além disso, foi demonstrado que Nurr1 protege os mDANs da morte induzida por neuroinflamação, suprimindo a expressão de genes pró-inflamatórios neurotóxicos4. Além disso, foi relatado que a expressão de Nurr1 está significativamente diminuída nos cérebros de pacientes com DP idosos e esporádicos18,19,20.

Nurr1 pertence à subfamília de receptores nucleares NR4A, sugerindo que sua função de transcrição pode ser modulada por ligantes sintéticos e/ou endógenos21. Além disso, Nurr1 pode funcionar como ativador transcricional e como repressor, dependendo do contexto celular (por exemplo, em mDANs16 e microglia4, respectivamente). Para começar a abordar se Nurr1 pode ser um alvo molecular para o tratamento modificador da doença de PD22, estabelecemos sistemas de ensaio de alto rendimento e selecionamos previamente uma biblioteca de medicamentos aprovados pela US-FDA. Identificamos três drogas, ou seja, amodiaquina (AQ), cloroquina (CQ) e glafenina, que aumentam significativamente a atividade transcricional de Nurr1 através da ligação direta ao seu domínio de ligação ao ligante (LBD) . Todas as três drogas compartilhavam uma estrutura química idêntica, a saber. 4-amino-7-cloroquinolina (4A7C), levando-nos a levantar a hipótese de que este motivo 4A7C representa uma relação estrutura-atividade (SAR) que poderia ser usada para identificar melhores derivados de 4A7C com maior potência e menores efeitos colaterais através de medicamentos baseados em SAR química24. Em consonância com esta hipótese, trabalhos recentes de Munoz-Tello et al. 25 e Willems et al. 26,27 mostraram que AQ e CQ e seus derivados podem funcionar como agonistas de Nurr1. Willems et al. 26 também relataram que a remoção do grupo 7-cloro ou 4-amino do farmacóforo 4A7C leva à perda de atividade, apoiando ainda mais nossa hipótese de que 4A7C é um farmacóforo válido para projetar agonistas potentes de Nurr1. Para esse fim, realizamos um esforço sistemático de química medicinal usando CQ como composto inicial porque é relativamente seguro e ainda é amplamente utilizado para tratar doenças humanas, como malária e doenças autoimunes28. Caracterizamos múltiplos (> 570) derivados de 4A7C usando ensaios bioquímicos, moleculares e celulares e identificamos um candidato final, 4A7C-301, que exibe potência robustamente maior e fornece efeitos neuroprotetores baseados em mecanismo em modelos in vitro e in vivo de DP , usando separadamente modelos de fatores de risco ambientais (o inibidor do complexo mitocondrial I 1-metil-4-fienilpiridínio (MPP +)) e genéticos (αSyn) da DP. Ao contrário da L-DOPA ou CQ, o 4A7C-301 melhorou significativamente as disfunções motoras e não motoras, sem efeitos colaterais, como comportamentos semelhantes à discinesia ou inibição da autofagia. Nossos dados demonstram a prova de princípio de que agonistas de Nurr1 otimizados podem fornecer tratamento modificador da doença para DP esporádica e familiar.

morpholine > piperidine, the derivative 4A7C-301 with highest fold-induction (18.12 fold) and significantly lower EC50 value (6.53 µM) than CQ (50.25 µM) was selected as a preclinical candidate for further studies (Fig. 1c; Supplementary Table 1). Brain permeability of 4A7C-301 was assessed by analysis of blood plasma and brain homogenates at different time points after oral administration in SD rats (20 mg/kg). 4A7C-301 penetrated into the brain well and was consistently maintained in the brain (Supplementary Fig. 1a–c)./p>60%) together with activation of ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba-1)-positive microglia. Pre-treatment with CQ or 4A7C-301 significantly rescued mDANs in a dose-dependent manner. 4A7C-301 showed maximal effect at 500 nM, which is a 40 times lower concentration than required for a similar CQ effect (20 µM) (Fig. 2d, e). In addition, 4A7C-301 optimally suppressed microglial activation against LPS at 500 nM, which is 40 times lower than CQ (Fig. 2f, g). To address whether CQ and 4A7C-301 can suppress the expression of pro-inflammatory genes in microglia (in the absence of mDANs), we used LPS to induce inflammation in mouse microglia-derived BV2 cells, leading to a dramatic induction of the tumor-necrosis factor-α (TNFα) gene, which was robustly suppressed by CQ and 4A7C-301 (Supplementary Fig. 6). In this assay, 4A7C-301 exhibited a much higher potency than CQ, with EC50 of ~1 and ~100 nM, respectively. Collectively, our data show that 4A7C-301 protects mDANs from MPP+- and LPS-induced cell death while suppressing neuroinflammation with a much higher potency than CQ for both effects./p> 0.05), one-way ANOVA. Data are mean ± s.e.m. n = 8 per group. g, h Immunohistochemical analyses of TH+ neurons by densitometry in the STR. Scale bar, 500 µm. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. i–k Immunohistochemical analyses of TH+ DA neurons (I, j) and NeuN+ neuros (I, k) in the SNpc. Scale bars, 500 µm.One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; j, n = 5 per group; k, n = 4 per group. Data are mean ± s.e.m. l Representative pS129 immunohistochemistry in the SNpc. Scale bars, 250 µm. m, Quantification of pS129 αSyn+ cells by counting. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. n Western blot analyses of human-αSyn in the SNpc of AAV-αSyn-injected mice. Values are expressed as a relative expression compared to contralateral side. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 3 per group. Data are mean ± s.e.m. o–q Immunohistochemical analyses of Iba-1+ microglia by counting in the STR (p) and SNpc (q). One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. Scale bars, 250 µm./p>570 derivatives of CQ and characterized them, resulting in the identification of an optimized agonist, 4A7C-301. Here, we tested 4A7C-301 and CQ for their effects on various in vitro and in vivo models of PD and propose that 4A7C-301 may provide a disease-modifying treatment for PD, as evidenced by the following results./p>20-fold), suggesting a mechanism-based Nurr1 activation. Our data revealed that 4A7C-301 effectively enhances both Nurr1’s transcriptional activator function (e.g., expression of mDAN-specific genes and production of DA in mDANs) and its repressor function (e.g., suppression of pro-inflammatory cytokine genes and microglial activation) with equally greater efficiency than CQ (>20-fold). Second, we observed that treatment with CQ or 4A7C-301 significantly restored Nurr1 protein levels that were reduced by MPP+ treatment and αSyn overexpression without change in their mRNA levels, strongly suggesting that Nurr1 ligands can regulate the levels of Nurr1 protein at the post-transcriptional levels. Thus, we speculate that Nurr1 ligands may regulate Nurr1 protein’s stability, which is vulnerable and down-regulated by environmental (MPP+) and/or genetic (αSyn) toxicity and that 4A7C-301 (and CQ to a lesser degree) exhibits neuroprotective effects by two distinct mechanisms: (1) activating Nurr1’s transcriptional function and (2) stabilizing and restoring Nurr1 protein levels. Third, using diverse cellular models, we found that 4A7C-301 substantially protects mDA cells via multiple downstream pathways such as reduction of oxidative stress and cytotoxicity, protection of mitochondrial function, induction of mDAN-specific gene expression, including GDNF-receptor c-ret, and reduction of neuroinflammation. Furthermore, while CQ inhibits autophagy, 4A7C-301 does not. In fact, 4A7C-301 restores cellular autophagy functions impaired by MPP+ treatment. Since CQ is a prototype autophagy inhibitor and known to accelerate the deposition of αSyn pathology55, CQ’s autophagy inhibition and 4A7C-301’s autophagy protection is an important distinction. We speculate that the same core structure allows CQ and 4A7C-301 to bind Nurr1 (related to the putative SAR) and show similar activities in most assays, while their different side chain structures most likely underlie their distinct effects on autophagy. In support of this, CQ and BafA1, both well-known autophagy inhibitors, significantly increased lysosomal pH, while 4A7C-301 had no effect, suggesting possible mechanisms underlying CQ/4A7C-301’s different effects on autophagy. Fourth, in MPTP- and αSyn-induced mouse models, 4A7C-301 significantly restored motor deficits and non-motor behavior (e.g., olfactory defects) without any dyskinesia-like side effects. A major limitation of current pharmacological treatments of PD is that they eventually induce side effects such as dyskinesia in many patients8,9. As expected, L-DOPA administration induced robust dyskinesia-like behavior in MPTP-induced mice. In sharp contrast, despite comparable improvements in motor tests, treatment with 4A7C-301 or CQ did not induce any detectable dyskinesia-like behavior. A possible action mechanism of 4A7C-301/CQ in the MPTP model is that they may influence metabolism of MPTP to MPP+. However, this explanation is unlikely because 4A7C-301/CQ were administered 6 h post MPTP injection, the time point when MPTP is completely metabolized into MPP+ in both the striatum and SN56./p>

50% of the observation time; 3 = display dyskinesia for the entire observation period but ceased upon external stimuli; 4 = display continuous and unceasing dyskinesia). To get a better and more sensitive validation of mice dyskinesia, we included an amplitude AIMs score, which rates the degree of deviation of body part or muscle position from its resting position on a 0-4 scale as previously described8. Finally, global AIMs score was calculated by multiplying basic AIMs and amplitude AIMs scores for each subtype on each session. Data points were plotted as the grand total of individual AIMs score on each testing day./p>